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概述

从群体遗传学理论上讲,遗传疾病源于生物个体遗传物质突变和遗传的对立统一。由于遗传物质突变的机制,同一物种生物个体之间存在着遗传物质的多态性。这种多态性随着物种的世代繁衍演进,那些不利于生物个体生存和发展的突变型逐步淘汰,而有利于个体适应环境和生存的基因型则经过长期积累在生物群体中占优势,并在逐代繁衍中得到巩固。但在不经人工选择的自然婚配的群体中,有害的突变型的消失却是一个漫长的过程。由于绝大多数有害基因突变型是隐性基因,有害基因的携带者仍表现正常,而使有害基因在群体中长期存在。一旦两个有害基因型的携带者婚配,或位于性染色体上的有害基因的携带者与正常人婚配,其后代中则会出现表现遗传疾病症状的个体。遗传疾病从分子水平解释,究其根源是由于与正常个体的遗传分子相比,患有遗传疾病个体的遗传物质发生了DNA序列或染色体片段上的改变。这种遗传物质上的异常在向代传递时遵循孟德尔遗传规律而可遗传给下一代。具体讲,较常见的突变情况有如下几种:(1)染色体某个区域的缺失;(2)某个基因的部分外显子或内含子的缺失;(3)基因的单碱基突变;(4)三核苷酸重复突变;(5)基因的一部分重复转录,而导致基因产物大小的改变;(6)插入突变,从基因组他部位的DNA片段插入到目的DNA序列内;(7)线粒体基因组的突变。一般来讲,遗传疾病的分子突变机制都比较复杂,往往包括上述的两种或两种以上的情况,如导致新生儿失盐症的21-羟化酶缺乏症,可由于21-羟化酶基因(Pc21)发生缺失或基因易位插入所致;杜氏肌营养不良症(Duchennemusculardystrophy,DMD)是由于抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因的部分缺失和重复造成。

应用分子生物学技术检测遗传疾病,又称遗传疾病基因诊断,是在分子水平上对核苷酸序列的突变进行检测,以在遗传物质的分子水平揭示疾病的发病机理和发病根源。分子生物学技术在人类遗传疾病诊断中的应用是近年来分子生物学理论和技术手段不断发展和成熟并在社会生活中逐步运用、普及的结果。

（一）分子生物学技术在遗传疾病诊断中运用概况

1.运用分子生物学技术进行遗传疾病诊断的原理与策略运用分子生物学方法诊断遗传疾病是近几十年发展起来的一个新的领域。它与传统的诊断方法有着本质的区别。传统的遗传疾病诊断方法有三种:临床学诊断、诊断和生物化学诊断。这些诊断方法都是以疾病的表型病变为依据。而表型则易受外界环境的影响,这就在一定程度上影响了诊断的准确性和可靠性。以分子生物学为基础的基因诊断则是在作为生命的遗传基础物质———DNA水平上对遗传疾病进行诊断,可揭示发病的遗传本质,不但可鉴定表现症状的有害基因纯合的个体,也可鉴定出没有异常表型的有害基因的携带者,尤其适于早期诊断。因而基因诊断与传统疾病诊断方法相比具有更准确、可靠并且诊断时间早的特点。在诊断时间上遗传疾病的诊断可分为产前诊断、症状前诊断和症状后诊断。从以预防为主、防患于未然的角度考虑,产前诊断和症状前诊断最为重要,而遗传疾病的基因诊断则是进行产前诊断和症状前诊断的最有效手段。就遗传疾病基因诊断的方式而言,可分为直接检测和间接检测两种。对于导致遗传疾病的有害基因的发病分子学机理已研究得很明了,而且如果遗传病症是由于一个或有限的几个已探明的基因突变造成,则可依据分子生物学技术,设计检验方法,对突变位点直接进行检测。在实际情况中,由于致病基因产生的突变多样化,或由于致病基因属于微效多基因,尚未确定和测序,因而无法用直接方法诊断。这种情况下可行的方法是通过对与之有连锁关系的DNA序列的多态性的检测,如限制酶酶切片段长度多态性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)和微卫星DNA序列(mi-crosatelliteDNA)来达到基因诊断的目的。这些与致病基因相连锁的具有多态性的DNA序列就被称为遗传标记。由于遗传标记和致病基因紧密连锁,在向后代传递遗传物质时,染色体DNA物质发生交换而相互分离的概率极小,而位于致病基因内部的遗传标记则是致病基因的组成部分。因而遗传标记和其连锁的致病基因被认为是共同遗传给下一代的。这样通过检测遗传标记的多态性,即可间接鉴定遗传疾病基因。现在较常见的遗传标记有限制酶酶切长度多态性、微卫星DNA序列等。随着人类基因组测序工作的完成,单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)也逐渐成为一种很有应用价值的遗传标记。SNP的研究将为揭示人类个体之间的遗传差异发挥重要作用。在运用遗传标记进行诊断时,为了增加基因诊断的信息量和可靠性,往往在待测基因的内部或两端侧翼序列中选择几个遗传标记,这样可使间接诊断更加准确可靠。与遗传疾病连锁的遗传标记的筛选和确定不但是一项繁重的实验室工作,而且也需要耐心细致的统计分析,这样才能保证遗传标记的准确性。遗传标记的应用可大大简化检测过程,拓宽基因诊断的运用范围。

2.遗传疾病基因诊断技术的发展概况

遗传疾病基因诊断技术的发展可分为以下几个阶段:第一阶段在20世纪80年代初以前,遗传疾病基因诊断主要是以DNA分子杂交(Southernblotting)方法完成,主要是RFLP方法。当突变基因座涉及酶切位点的增减时,用特定的限制酶可将DNA切成在长度上与正常基因组DNA不同的片段。这种限制酶酶切片段能以共显性的方式遗传,因而是很好的遗传标记。在操作中,酶切待测样品DNA,经电泳后将DNA片段转移到固相,以与待测序列同源、经过标记的DNA片段为探针,进行杂交,通过放射性自显影或其他显色方法,可测查出待测样品的基因型。应用这种方法,美籍华裔科学家简悦威于年首次发现了人体β-珠蛋白基因HpaI酶切多态性与镰状细胞贫血密切相关,并以此作为遗传标记,首次建立了镰状细胞贫血的基因诊断方法。虽然分子杂交的检测方法可鉴定有害基因型,但往往需要大量的样品DNA,技术过程较复杂,并且探针多用同位素标记,对人体有损害。这一时期是基因检测的初级阶段,检测的遗传疾病种类较少。遗传疾病基因诊断技术发展的第二阶段是在年美国人KaryB.Mǜllis等创建聚合酶链反应(polymerasechainre-action,PCR)之后。由于PCR技术只需要简单的操作就可在普通实验条件下使所需要的靶DNA序列在短时间内得到大量扩增,从而突破了在以往研究中不易获取丰富量靶DNA的瓶颈,在分子生物学技术领域引起了一场革命。PCR技术于由其适用性强、操作方便、快捷,已广泛应用于遗传疾病基因诊断领域。以PCR技术为基础,衍生出了许多灵敏而便捷的基因诊断方法,较成熟的方法主要有:PCR-RFLP方法,是检测与特定的酶切位点有关的突变的简便方法;等位基因特异性PCR(allelespecificPCR,AS-PCR)[7],该方法针对等位基因序列设计引物,可根据PCR产物的有无来鉴定基因型;PCR单链构型多态性技术(singlestrandconformationalpolymor-phism,PCR-SSCP)[8],该方法在PCR产物变性后,在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳,PCR产物的序列中碱基突变可使DNA分子构型产生差异,而在电泳中的迁移率有所改变,从而可以揭示PCR产物序列内的多态性;多重荧光PCR-STR(simpletandemrepeat,STR)可用于检测与微卫星多态性遗传标记连锁的遗传疾病。PCR技术和蛋白质免疫技术结合出现了新型的免疫PCR基因探针。用特殊的具有共价结合能力的分子,如生物素———亲合素、叶绿素等连接蛋白质和核酸,构成了有特异性抗性的抗体基因探针。这一复合型的探针可对基因的表达产物进行诊断。在实际操作中复合型探针的抗体部分特异性地与目的基因表达产物结合,洗脱不能结合的探针,对探针的基因部分进行PCR扩增,根据PCR产物的有无来检测是否存在目的基因的表达产物。免疫PCR基因探针集中了免疫反应的高度特异性和PCR反应的高度灵敏性,检测灵敏度比ELISA高～。该技术目前虽仍处于研究阶段,但它为遗传疾病的检测提供了新的思路和方法,具有较好的应用前景。近年来,一种新物质———肽核酸,逐步应用于PCR检测,为以PCR技术为基础的检测方法开辟了新领域。肽核酸(peptidenucleicacid,PNA)是一种由重复的N-(2-氨基乙基)甘氨酸单位构成的多肽样骨架,每个单位间由酰胺键连接,碱基则利用亚碳酰键连接到肽骨架上。与DNA分子相比,PNA实际上是以酰胺链连接骨架替代了核苷酸中核糖磷酸二酯键骨架。PNA与DNA或RNA可结合成高稳定性的DNA-PNA或RNA-PNA双链结构,对碱基错配很敏感。PNA与靶DNA出现一个碱基的错配时,它们之间的结合效率就明显下降;出现两个碱基错配时,PNA和靶DNA则不能形成双链结构。利用PNA此特点,可用类似于等位基因特异性PCR的PNA定向PCR钳技术(peptidenucleicacid-directedPCRclampingtechnique)检测基因的点突变情况。在PNA定向PCR钳技术的PCR反应体系中,包括一个PNA片段和两条寡聚核苷酸引物,其中,PNA与正常基因型DNA的5′端互补,寡聚核苷酸引物中的一条与DNA突变型的5′端互补,另一条是共有的3′端物。如果待扩增的DNA模板中没有发生点突变,则PNA片段与DNA模板相连,PCR被终止;反之,如果DNA模板中存在突变点,则寡聚核苷酸引物可与DNA模板互补结合,PCR得以进行。通过改变寡聚核苷酸引物和PNA片段,该技术可检测出不同的点突变。这在检测与SNP相关的点突变中有很好的运用前景。分子生物学诊断方法的第三个阶段是以基因芯片(DNAchips)为代表的高通量密集型技术。基因芯片技术早期被称为逆向点杂交技术(reversedotblot,RDB),是由Saiki等于年首次提出。基因芯片的工作原理为:如果了解了某一基因的突变情况,就可根据基因的多态性位点所对应的等位基因型,设计等位基因特异性的寡核苷酸(allelespecificoligonucleotide,ASO)探针,用电脑制控的机械臂将ASO精密地排列在尼龙膜或其他固相支持物表面,然后与经过标记的DNA片段(一般为经过PCR扩增的DNA片段)进行杂交,洗脱未结合的标记DNA片段,通过特定的显色或激光扫描(用荧光标记的DNA片段),对杂交结果进行处理分析,即可检测出待测样品的基因型。基因芯片最新的发展表明,该项技术正进一步向精密化和自动化的方向发展。近年来开发的DNA芯片系统,采用荧光素标记DNA片段,应用激光扫描技术进行杂交结果的荧光信号采集。由计算机处理荧光信号,并对每一点的荧光强度数字化后进行分析,从而大大提高了样品处理的自动化程度和检测结果的准确性。基因芯片技术由于具有处理样品能力强大、自动化程度高、结果分析准确可靠,而具有以往基因诊断方法不可比拟的优点。尤其在检测突变型较多的遗传疾病方面,更加便捷、准确、可靠。如Beta-地中海贫血,在全球发现了种以上的突变型,用传统的方法若对待测样品的这些突变点一一进行检测不仅耗费大量的时间和人力,而且易出差错。应用基因芯片技术可在一个工作日内检测所有这些突变型,而且准确性很高。于由基因芯片技术在工作原理和样品结果处理过程方面突破了传统的检测方法,具有样品处理能力强、用途广泛、自动化程度高等特点,具有广阔的应用前景和商业价值,现已成为分子生物学技术领域的一个热点。目前有关基因芯片的研究方兴未艾,现在许多国家都投入巨资进行该方面的研究和开发工作。基因芯片技术在遗传疾病基因诊断方面的应用究其根源是建立在对基因突变情况的了解的基础上的。如果对某一基因的有害突变型不甚了解,则无法设计出用于检测的等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针。就目前的情况来看,基因芯片主要运用于突变情况清晰的遗传疾病的测检,如Beta-地中海贫血、囊性纤维变(cysticfiorosis,CF)等。随着人类基因组计划的逐步完成,研究的重点将转向人类基因结构和功能的研究,其中基因的突变型对功能影响的研究将是后人类基因组计划的重要内容。这方面的研究成果必将极大地推动基因芯片技术的发展,使基因芯片技术成为基因突变分析重要而有效的手段。

（二）遗传疾病基因诊断技术的发展前景和存在的问题

近几十年来随着分子生物学理论和技术的不断发展和丰富,遗传疾病的基因诊断技术有了长足的发展,尤其是在PCR技术及基因芯片技术发明之后,很大程度上推动了基因诊断技术的发展。近年来随着人类基因组计划的实施和逐步完成,为人类遗传疾病的研究和基因诊断技术的发展注入了新的力量,必将极大地推动遗传疾病基因诊断技术的应用和普及。年6月,人类基因组计划已完成了人类基因组草图的绘制。人类基因组的精细图谱可在近年内完成。就目前的研究结果来看,人类DNA序列99.9%是共有序列,有0.1%的核苷酸序列存在着变异。近年来人类基因组单碱基突变(SNP)的研究,已成为热点。在人类基因组序列中已发现了超过0000个SNP。SNP的研究成果有望揭示人类个体之间的遗传差异,为人类遗传疾病的基因诊断提供重要的理论依据。同时,遗传疾病的诊断技术将越来越多地和新材料学,以及信息学领域的最新技术成果结合,向着遗传疾病基因检测的精密化、自动化方向发展。其中基因芯片技术将有望成为遗传疾病诊断的主要技术手段。在遗传疾病基因诊断方面仍存在着一些问题,它们在一定程度上制约了遗传疾病基因的研究和基因诊断技术的运用。遗传疾病具有典型的家族特征,相对封闭的较完整家系是研究遗传疾病基因的最好材料。但随着社会的发展,人口流动性愈来愈强,这样的家系极少发现;此外,有些遗传疾病由多个基因座突变造成,调查这些基因座的突变背景,往往需要长期细致的实验工作和研究积累。这些都给遗传疾病的基因研究工作带来了困难。在遗传疾病基因诊断技术方面,有些诊断方法易出现假阳性现象;一些最新发展起来的基因诊断技术存在着成本较高和诊断费用过高的问题,而不少已有的基因诊断方法由于过程复杂、操作要求较高而难以推广,这些问题制约了遗传疾病基因诊断技术的应用和普及,需要进一步锤炼技术过程加以解决。在社会学方面存在的问题主要有:在遗传疾病的基因研究中如何保障提供样品者的知情权问题;一个基因的发现者是否对其拥有专利权而可制约他人对该基因的研究工作;基因诊断呈阳性但尚未表现出遗传疾病症状者是否可以进行医疗保险等。这些虽然都属于社会学范畴的问题,但一项新兴的技术能否在社会上应用和普及,不但取决于技术本身的成熟程度,更有赖于人们对该技术的接受程度。因此,遗传疾病基因诊断技术的应用,必须考虑到其社会影响因素。随着分子生物学理论和技术的不断发展,遗传知识的普及和社会有关法规和社会保障体制的建立,遗传疾病基因诊断技术在提高人口遗传素质面将发挥越来越重要的作用。

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生物芯片技术与遗传病诊断

1.生物芯片简介

随着人类基因组计划及后基因组计划的进行，生物芯片技术在美国硅谷诞生。生物芯片的概念源于计算机芯片，是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄像机对杂交信号的强度进行快速、并行、高效的检测分析，从而判断样品中靶分子的含量。由于常以玻片或硅片作为固相支持物，且制备过程类似计算机芯片的制备，故称之为生物芯片技术，不同的是在计算机芯片上排列的是集成电路，而生物芯片上排列的是密集的探针阵列。生物芯片技术将生命科学研究中所涉及的不连续的分析过程（样品制备、化学反应和分析检测）连续化、集成化、微型化，具有高信息量、快速、微型化、自动化、成本低、污染少、用途广等特点。生物芯片技术被认为是继20世纪大规模集成电路之后又一次具有深远意义的科学技术革命。目前，生物芯片研究领域主要包括基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室，此外，还包括组织芯片、细胞芯片、糖芯片、电子芯片、三维芯片和流式芯片。基因芯片是将DNA或寡聚核苷酸固定在固相支持物上，让经过处理的生物样品中的DNA或RNA与之杂交，再通过特定的方法检测并进行数字化处理，从而得出待测样品的核酸信息。蛋白质芯片又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是一项高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术，是最具发展潜力的一类生物芯片。目前主要分为两种：第一种称为亲和表面芯片，是较为常用的一种，其原理就是将大量的蛋白质、蛋白质检测试剂或检测探针以预先设计的方式固定在玻片、硅片及纤维膜等固定载体上组成密集的阵列，利用抗原－抗体、受体－配体和特异的蛋白－蛋白相互作用的原理，捕获特异的和特殊修饰的蛋白质；第二种称为微型化凝胶电泳板，即样品中的待测蛋白在电场作用下通过芯片上的微孔道进行分离，然后经喷射进入质谱仪中来检测蛋白质的分子量及种类。由于蛋白质芯片的探针蛋白特异性高、亲和力强，所以对生物样品的要求较低，故可简化样品的前处理，甚至可直接利用生物材料进行检测，蛋白质是基因表达的最终产物，因而它比基因芯片更进一步的接近生命活动的物质层面，蛋白质芯片能同时检测生物样品中与某种疾病或环境因子损伤可能相关的全部蛋白质含量的变化情况即表型指纹，对监测疾病的进程和预后及判断治疗效果有重要意义。生物芯片发展的最终目标是将生命科学研究中所涉及的许多不连续的分析过程通过采用像集成电路制作中的半导体光刻加工那样的微缩技术，移植到芯片上进行，形成微型全分析系统，即芯片实验室。所以说，芯片实验室是最理想的生物芯片，是未来生物芯片发展的最终目标。芯片实验室可以完成对样本的预处理、分离、稀释、混合、化学反应、检测及产品的提取，从而使现有烦琐的、不精确的生物分析过程自动化、连续化和微缩化，成本更低廉，使用更方便。利用这种方法可以准确快速地大量检测遗传性、家族性、地方性和流行性疾病，甚至癌症等其他疾病。

2．生物芯片的应用

作为一种新兴的高技术，生物芯片的应用领域越来越广泛。特别是在医学方面，生物芯片中最成熟的基因芯片技术可用于基因表达谱研究、基因突变研、基因组分型及测序和重测序等方面。在药物学领域，生物芯片可以应用于疫苗研制、药物中有效成分的筛选、中药安全性检测和中药材品质鉴定。在医学检验领域，生物芯片已经逐渐开始应用于临床细菌检测、肝病检测、艾滋病检测、肿瘤和血液病检测和遗传病检测。其中，生物芯片在遗传病诊断方面有极高的应用价值。以往，在临床上，人们因为无法鉴定基因的分子缺陷，对遗传病的诊断主要是通过对病史、症状和体征进行分析，并通过家系分析以及实验室检查等手段来完成的。这些方法都是对疾病的结果进行分析，再由结果追溯原因。近20年来，随着分子生物学技术的发展，人们可以直接从遗传病病因即导致疾病的基因入手来进行遗传病的诊断，人类基因组计划完成后，越来越多的遗传病发病机制被阐明，但如何能够快速准确地检测基因的突变则成为一个需要解决的问题，而DNA芯片技术正是随着这一计划的进展而发展的，为后基因组时代的基因功能研究提供了技术装备。利用基因芯片技术，通过分析和检测患者某一特定基因，即可诊断遗传病患者，也可诊断有遗传病风险的胎儿，甚至是着床前的胚胎。

（1）遗传病致病基因的定位人类基因组计划使许多遗传病的致病基因被定位，如肥胖病、老年痴呆症、亨廷顿舞蹈症、精神疾病等。基因定位蕴含着巨大的商业价值，年，美国昂飞（Affymetrix）公司下设的实验机构用已知的个具有多样性的人类基因，制备了携带有种位点变异的DNA芯片。生物学家通过对遗传病家谱进行研究，可将某一遗传病的基因和一种或多种多样性联系起来，遗传病基因在染色体上的位点将通过这种联系被具体地定位。以往的突变及多态性检测手段均不适宜大规模、低消耗和自动化的要求，应用基因芯片可以克服这方面的不足。如昂飞公司把p53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成p53基因芯片，用于p53肿瘤抑制基因的多态性检测，在癌症早期诊断中发挥重要作用。

（2）遗传病的检测地中海贫血是危害最严重的遗传病之一，重型地中海贫血儿的出生给社会和家庭带来了沉重的经济、精神和生育负担，目前尚无理想的根治方法。应用先进的基因芯片技术进行产前基因诊断，选择性淘汰重症患儿的出生，提高人口素质，是首选的预防措施。

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外显子捕获技术与单基因遗传病诊断

1．全外显子组捕获－第二代测序技术鉴定致病基因的策略

自年9月起，一种全新的寻找疾病致病基因或易感基因的方法－全外显子组测序(wholeexomesequencing，WES)开始显露头角，发挥了越来越多的重要作用，并已被用于临床基因诊断。外显子组(exome)即一个个体的基因组DNA上所有蛋白质编码序列(即外显子。exon)的总和。人类外显子组序列仅占人类整个基因组序列的1%，约为30Mb，包括18万个左右的外显子，估计85%的人类致病突变都位于这1%的蛋白质编码序列上。因此，对各种疾病患者的外显子组进行测序分析，所针对的是与疾病最相关的“编码序列”即区域exome，捕捉的是疾病的大部分致病突变信息。在单基因致病基因的定位中，普遍的做法是假设致病突变为一个患者共有稀有突变，在常用数据库中不存在，故常用的策略是将测序得到的变异体过滤常用数据库(如dbSNP数据库、HapMap计划数据库和千人基因组计划数据库)。有的学者也利用自己的数据库(inhousedatabase)进行过滤。国内的研究则还可利用炎黄计划数据库。外显子组测序的优势还有:①得到的是数字信号而非芯片模拟信号；②可挖掘＜5%的稀有突变，全面地分析与疾病相关的数据；③研究效率高，经费投入的性价比高。因而，该技术既可用于发现罕见单基因疾病的致病基因，进而也可推广到多基因复杂性疾病的研究中。显然，借助于外显子组捕获和第二代测序技术的所需样本数量少、低费用、高通量的优势和特点，可以大大加快鉴定人类疾病基因的进程。近几年来，外显子组测序已对许多疑难杂症的致病基因进行了定位克隆。外显子组捕获测序在Freeman－Sheldon和Miller综合征中应用成功后，有学者又用该技术成功鉴定了Kabuki综合征的致病基因MLL2。对2例无血缘关系的家族性混合型低血脂症(familial