摘要

不同的肿瘤微环境决定了PD-1/PD-L1阻断的疗效

背景:程序性死亡配体-1（PD-L1）的表达不是晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者抗PD-1/PD-L1治疗效果的完全可靠的预测指标。免疫相关肿瘤微环境（TME）根据肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）状态和PD-L1表达分为四种不同类型。

方法:我们回顾性分析了年至年间接受抗PD-1/PD-L1治疗的晚期非小细胞肺癌患者。我们研究了抗PD-1/PD-L1治疗的疗效、基于PD-L1（克隆：22C3）表达的TME类型、通过免疫组织化学评估的CD8阳性TILs密度以及通过下一代测序评估的突变谱之间的关联。

结果:总的来说，名患者被纳入分析。患者分为四组：I型：PD-L1高（肿瘤比例评分[TPS]≥50%/升(≥85/mm2；n=73）；II型：PD-L1低（TPS50%）/TIL低（85/mm2；n=70）；III型：PD-L1高/低（n=37）；IV型：PDL1低/高（n=48）。抗PD-1/PD-L1治疗的客观有效率（ORR）和无进展生存率（PFS）因TME类型不同而明显不同（ORR和PFS；I型：64%，14.5个月；II型：12%，2.1个月；III型：24%，3.6个月；IV型：41%，10.8个月）。在PD-L1高肿瘤患者中，I型肿瘤的ORR和PFS明显优于III型肿瘤（ORR:p0.，PFS:p0.）。TP53和KRAS突变的存在分别与TILHigh（I型和IV型）和PD-L1High肿瘤（I型和III型）显著相关。

结论:不同类型的TME，包括PD-L1表达和TIL状态，可以准确预测抗PD-1/PD-L1治疗的疗效。

关键词：非小细胞肺癌（NSCLC），抗PD-1/PD-L1（程序性死亡-1/程序性死亡配体1）抗体，肿瘤微环境（TME），CD8阳性肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的密度

背景

抗程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）/程序性死亡配体-1（PD-L1）抗体（nivolumab、pembrolizumab和atezolizumab）可抑制PD-1通路，并通过T细胞再生诱导抗肿瘤作用，从而提高晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者的生存率。肿瘤细胞上PD-L1表达已成为晚期非小细胞肺癌抗PD-1/PD-L1治疗的预测指标。Pembrolizumab在PD-L1表达强阳性的NSCLC患者中显示出明显优于铂双联化疗的疗效和更长的生存期(≥50%)。然而，PD-L1表达并不是抗PD-1/PD-L1治疗效果的完全可靠的预测指标，因为PD-L1表达强阳性的晚期非小细胞肺癌患者对彭布罗利珠单抗的应答率为44.8%基于KEYNOTE-研究。

肿瘤突变负荷（TMB），当与肿瘤免疫原性相关的新抗原数量增加时，也被报道为黑色素瘤、NSCLC和尿路上皮癌等几种癌症的预测标志物之一。美国食品和药物管理局最近加速批准pembrolizumab用于既往治疗后进展的不可切除或转移性TMB-high(≥10突变/兆巴酶[mut/Mb])的成人和儿童患者，以及没有令人满意的替代治疗选择的患者。美国食品和药物管理局最近批准了pembrolizumab用于治疗成人和儿童不能切除或转移性TMB高风险的加速批准(≥10个突变/megabase[mut/Mb]），这些突变在先前的治疗和没有令人满意的替代治疗方案的患者中发生。此外，在晚期非小细胞肺癌患者中，TMB加PD-L1表达进一步丰富了抗PD-1/PD-L1治疗的益处，因为TMB和PD-L1表达是独立因素。肿瘤微环境（TME）中CD8阳性肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的存在也是晚期黑色素瘤和NSCLC患者免疫检查点抑制剂疗效的预测因素。此外，TME根据TIL状态和TCs上PD-L1表达分为四种不同类型：I型（PD-L1阳性，TIL产生适应性免疫抵抗）、II型（PD-L1阴性，无TIL指示免疫耐受）、III型（PD-L1阳性，无TIL指示内源性诱导）和IV型（PD-L1阴性，TIL指示其他抑制因子在促进免疫耐受中的作用）。然而，没有研究评估TME类型如何影响晚期NSCLC患者抗PD-1/PD-L1治疗的疗效。

本研究根据晚期非小细胞肺癌患者的四种不同TME类型评估抗PD-1/PD-L1治疗的疗效。此外，还评估了包括TMB在内的肿瘤的突变谱与TME分类的关系。

对象和方法

研究对象与设计

这项回顾性研究包括在年4月至年4月期间接受抗PD-1/PD-L1抗体（nivolumab、pembrolizumab或atezolizumab）治疗的晚期非小细胞肺癌患者，他们有足够的肿瘤组织用于医院（日本东京）TME中PD-L1的表达和CD8阳性TIL的密度。我们的研究排除了表皮生长因子受体（EGFR）突变、间变性淋巴瘤激酶（ALK）、c-ros癌基因1（ROS1）和在转染过程中重排（RET）的患者。收集以下资料:分期，按第8级肿瘤、淋巴结、转移(TNM)分类;在诊断年龄;性;吸烟状态;东部合作肿瘤学组表现状况(ECOGPS);和组织学。根据实体肿瘤疗效评价标准1.1版评估肿瘤疗效。应答者被定义为对抗PD-1/PD-L1治疗有部分或完全应答的患者。

TME中TCs和CD8阳性TIL上PD-L1表达的分析

在福尔马林固定的石蜡包埋标本上，使用DakoAutostainerLink48平台（Dako，Agilent）对PD-L1（克隆22C3）和CD8（Dako，Agilent）进行免疫组织化学（IHC）染色。所有染色的幻灯片使用NanoZoomer2.0-HTWholeSlide1Imager(滨松光电，滨松，日本)在×40分辨率进行数字化处理。在本研究中，细胞学样本、无肿瘤组织碎片的抽吸样本以及无法识别肿瘤和间质区域的细胞阻断样本均被排除在TIL评估之外。包括至少个存活肿瘤细胞在内的肿瘤组织样本可用于评估PD-L1表达和TILs的状态。我们根据制造商的方案评估PD-L1表达作为肿瘤比例评分(TPS)。CD8TILs的密度计算如下:在扫描数字图像上，两名研究人员(包括一名认证的病理学家)标注了肿瘤区域的热TIL点，该热TIL点包含肿瘤细胞巢，而不包含周围的间质组织(补充图1)。接下来，我们选择了两个点(大小:0.1mm2)每个核。注释区域由NDP查看器(版本2.6;滨松光电，滨松，日本)。在注释区域内，计数CD8阳性细胞的数量。TIL密度（每1mm2的阳性TIL）计算为阳性细胞数除以标注的面积大小。

用于分析肿瘤突变谱的下一代测序（NGS）测试

进行NGS测试以分析突变谱。简单地说，从肿瘤和患者匹配的血液样本中提取DNA。NGS库是使用NCCOncopanelver编写的版本4，靶向个癌症相关基因。所有肿瘤样本的平均测序覆盖率为×，最小覆盖深度为×。TMB被定义为所检测基因组每兆碱基的体细胞突变数（即突变总数除以1.38Mb[NCCOncopanel4版覆盖的目标区域的基因组大小]）。所有的碱基替换和INDEL在预先证明目标基因编码区的期刊上都被统计，包括同义改变。根据之前的研究，我们确定TMB高截止值为10mut/Mb。

致癌/致病突变的分类

测序读数被映射到UCSC人类参考基因组（GRCh37）。首先，使用以下标准选择体细胞突变：（1）肿瘤组织中6个体细胞突变的变异等位基因频率超过4%，（2）如果单核苷酸多态性显示出阈值等位基因频率，则它们被去除7个≥0.01在NHLBIGO外显子组8测序项目（ESP）中(