摘要
目的:本研究的目的是阐明间变性淋巴瘤受体(ALK)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)耐药机制的细节，并利用分子动力学(MD)模拟预测新的耐药基因改变。
方法:共有21例ALK-阳性非小细胞肺癌(NSCLC)患者在ALKTKI失败后再次进行活检纳入本分析。对初始和再活检肿瘤标本进行ALK荧光原位杂交和逆转录聚合酶链反应。
结果:9例患者无已知ALK耐药机制。4例有ALK扩增。LM、IN和GA突变已知表明对ALK-TKIs耐药，在每个患者中检测到。小细胞癌和肉瘤样转移各1例。在第二代ALK-TKIs后检测到LQ、PH和exon24插入76bp。
结论:将遗传分析与计算模拟模型相结合，可以预测克服ALK-TKI耐药的耐药机制，构建基因组与模拟融合数据库对该领域个性化医学的发展具有重要意义。
引言
非小细胞肺癌(NSCLC)在分子水平上是一种异质性疾病，一些驱动基因改变，包括功能获得突变、基因扩增和基因重排，已经被确认。ALK重排定义了一种独特的分子亚型，据报道，这种癌蛋白大约在4%至5%的NSCLC病例中存在，但在地理位置[1][2]的发生率上没有显著差异。ALK-酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)在ALK重排NSCLC患者中显示了明显的肿瘤收缩，由于几乎所有肿瘤对ALK-TKIs产生耐药性的原因有:1)ALK酪氨酸激酶结构域的点突变，2)ALK扩增，3)旁路通路的激活，以及4)组织学转化[3,4]。耐药基因突变与ALK-TKIs易感性之间的关系差异很大[5]，使得这些耐药突变的准确频率未知。此外，随着ALK抑制剂的不同，耐药机制也有很大差异，这使得临床研究ALK抑制剂耐药的机制、发生率和特点更加困难。
我们在此报告了我们对已知的第一代和第二代ALK-tkis的机制的评估，包括克唑替尼、阿来替尼、lorlatinib和ceritinib，在日常临床设置。在本研究中，我们使用重新活检肿瘤组织标本分析了21例ALK-TKI耐药患者，发现了3个可能是由ALK-TKI耐药引起的新基因改变。
患者和方法
患者的临床背景特征
在年1月至年6月期间，共有21例ALK-重排NSCLC患者对耐药肿瘤进行了重复活检。本回顾性研究经爱知县癌症中心机构审查委员会批准(No:-1-)。这项研究是根据《赫尔辛基宣言》的原则进行的。
ALK-TKI抗性分析
ALK-TKIs治疗组分别为克唑替尼(mg×2/d)、阿来替尼(mg×2/d)、lorlatinib(mg/d)、ceritinib(mg/d)。在病情进展时进行了再次活检。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测ALK融合变异体，采用荧光原位杂交(FISH)法检测ALK扩增情况，正如文献（VysisALKBreakApartFISHProbeKit;Vysis,Inc,DownersGrove,IL,USA）报道[17][18]。
alk-药物复合物的分子动力学模拟和结合自由能估算
人ALK与crizotinib、alectinib、ceritinib、lorlatinib复合物的初始结构数据来自蛋白数据库(PDB代码:2XP2、3AOX、4MKC、4CLI)。利用分子工作环境(MOE)[6]中的结构制备模块对无序环和柔性侧链的结构进行建模。克唑替尼、阿来替尼、ceritinib和lorlatinib在溶液中质子化形成电离态，它们的净电荷分别为+1、+1、+1和0。正如我们之前报道的[7]，我们制备了ALK-drug复合物的计算系统，并进行了MD模拟。采用MP-CAFEE(良好平衡状态下绝对结合自由能的大规模并行计算)计算ALK-drug结合自由能(?G)，这是炼金术自由能微摄法之一[8]。
结果
21例患者在ALK-TKIs术后进行了再次活检(补充表1和补充图1)。KLC1exon9-ALK外显子20,KIF5Bexon15-ALK外显子20。4例患者ALK扩增。每个患者都检测到LM、IN和GA三个已知的表明对ALK-TKIs耐药的突变。小细胞癌和肉瘤样转变各1例。第二代ALK-TKIs后，临床检测LQ、PH和exon24插入(ins.)76bp(补充图2、3、4、5)。硅分子模拟显示，当LQ、PH和exon24R-D插入突变发生在ALK激酶结构域时，ALK-tkis的结合亲和力发生变化。为了研究耐药的分子机制，我们对这些新突变体进行了ALK-药物复合物的硅分子模拟。我们的模拟表明，与野生型(WT)ALK相比，LQ由于失去了vanderWaals(vdw)相互作用而降低了与crizotinib的结合亲和力。同样，vdw相互作用的降低也显著促进了耐药，即表现出对阿替尼和ceritinib的耐药。这些分子模拟的结果与细胞系[7]分析的结果一致(图1)。LQ与LM的不同之处在于，模拟过程中lorlatinib的结合位置发生了显著变化(图1d)，说明LQ抑制了药物的疗效，尽管预测的?G变化不明显。
PH位于距离TKI结合区相对较远的位置(补充图6)。在模拟中，PH对crizotinib有抗性，但对其他TKIs无抗性(图2)。虽然R-D插入没有诱导对crizotinib的耐药，但由于vdw相互作用减少了结合亲和力，导致对alectinib和ceritinib的耐药(图3)，这一结果也与临床过程一致。
讨论
在本研究中，我们揭示了抗ALK-TKIs的新机制，包括LQ、GH和exonbp插入(MD模拟exon24R-Dins)。耐药机制由ALK-tk病变突变(6/21,28.6%)、ALK基因扩增(4/21,19.0%)和组织学转化(2/21,9.5%)诱导;然而，在近一半的病例(9/21,42.9%)中，耐药机制尚不清楚。在以往的报道中，Solomon等报道了一线ALKTKI处理后ALK突变率为16.6%(14/84)，至少2个ALKTKIs[10]处理后ALK突变率为29.2%(31/)，Philippe等也观察到1次ALKTKI处理失败后ALK突变率为15%，2次ALKTKI处理[11]处理失败后ALK突变率为33%。ALK融合基因扩增，单独或联合次级突变，导致的次级耐药小于20%[11,12]。在目前的数据中，ALK扩增病例比较频繁，未知病例比较少见，考虑与FISH执行率有关，与之前的报告基本相同。通过计算MD模拟，本研究发现ALK-LQ与crizotinib、alectinib、ceritinib、lorlatinib的结合亲和力低于ALK-WT(图2)。在我们组中，ALK-LQ的一半最大抑制浓度(IC50)也有报道，ALK-wt对alectinib的一半最大抑制浓度(IC50)也高于ALK-wt对alectinib的一半最大抑制浓度(IC50)，与该MD模拟模型[7]相匹配。在本研究中，这种新的点突变是在给药阿立替尼和ceritinib后检测到的(补充图1)。因此LQ是由阿替尼和ceritinib的药压诱导的，在临床环境中表现出对这两种药物的耐药。他的肿瘤也表现出对氯拉替尼的耐药，这与目前的MD模拟一致。在检测LQ时，通过分子模拟发现现有的包括crizotinib在内的ALK-TKIs在这种情况下并不有效。同样，ALK-76bp蛋白与alectinib和ceritinib的结合亲和力低于ALK-WT(图4)。这种插入改变是在ceritinib和alectinib治疗后发现的(补充图3)，因此根据MD模拟，crizotinib被认为是复发病例的可行给药选择。PH在克里佐替尼和阿列替尼治疗后获得，也表现出对ceritinib的耐药(补充图2)。然而，由于PH突变位点距离Atp结合位点相对较远，MD模拟仅对克里佐替尼耐药;因此，在这种情况下可能存在另一种尚待确定的耐药机制。
总之，我们发现了三个新的ALK-TKI耐药基因改变。该计算模拟模型可用于预测硅中克服ALK-TKI抗性的机制。与基因组信息一样，模拟数据库的构建对于建立个性化药物，减少实验浪费，降低药物开发成本具有重要意义。
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